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本文刊于：中华心血管病杂志,,49(3):-
作者：林颖胡豪畅成绩陈若愚王双双陈晓敏
单位：医院心血管内科宁波大学医学院
摘要
动脉粥样硬化是以脂质沉积和斑块形成为主要特征的慢性进行性血管炎症，目前临床上主要采用药物调脂和手术治疗。间充质干细胞作为一种具有自我更新和多分化潜能的干细胞，其在心血管领域发挥着重要的炎症-免疫调控功能，尤其在动脉粥样硬化进程中。该文主要总结目前关于干细胞的作用机制和其在动脉粥样硬化发生发展中对内皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞的功能调控作用，以及提高干细胞治疗效果的方法，拟为以间充质干细胞为基础的动脉粥样硬化治疗研究提供进一步的思路。
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种由脂质代谢紊乱导致的、以血管炎症反应和免疫反应失衡为主要病理基础的、与衰老相关的慢性退行性疾病。目前研究发现，血管内皮细胞、平滑肌细胞和免疫细胞均参与了动脉粥样斑块形成、进展和破裂等各个阶段。在过去几十年，尽管我们对于AS的研究已经取得了很大的进展，目前临床上治疗AS仍以调节血脂水平为主，如他汀类药物。间充质干细胞（mesenchymalstemcells，MSC）是一类具有多分化潜能和自我更新能力的干细胞，因其具有来源丰富、易于培养和扩增等优势，一度成为各大研究领域的热点。虽然近几年来干细胞在体内的分化能力备受质疑，但不可否认的是，在多种动物疾病模型中干细胞已被证实可以通过分泌各种生物活性物质发挥其独特的抗炎和免疫调控作用，包括AS、心肌梗死、阿尔茨海默症、下肢缺血损伤等［1］。在体研究表明MSC对动脉粥样斑块的保护作用主要表现在抑制斑块形成和促进斑块稳定两个方面［2］。MSC可以通过分泌抗炎因子、抑制血管炎症反应、调控斑块内细胞成分、改善内皮细胞功能和减少病灶内的凋亡细胞数量等调控AS的进展［3］。然而，已有的文献报道中MSC治疗AS的疗效不一致，其调控作用受细胞衰老、培养和移植微环境、移植前预处理等多种因素影响［4］。本文将总结当前MSC在调控AS发生发展中的相关研究，并提出目前面临的困难以及可能的解决方法，拟为干细胞治疗AS进一步提供可靠的依据。一、干细胞的作用机制近十年来，以干细胞为基础的治疗研究已在各种临床前和临床试验中广泛开展。例如，在心肌梗死小鼠模型中进行MSC移植，发现其能有效减轻炎症反应和减少心肌凋亡；原位心肌注射MSC可减少促炎因子，如白细胞介素（IL）-1、IL-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌，增加抑炎因子如IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）的分泌，同时分泌血管内皮生长因子和肝细胞生长因子促进心肌细胞新生和抗凋亡［5］。而注射经缺氧诱导的MSC条件上清也具有与MSC移植相似的效果，进一步证实了MSC的旁分泌作用对于疾病进展和消减有重要影响［6］。MSC分泌的各种生物活性物质成分（包括细胞外囊泡、生长因子和趋化因子）及其分泌谱的组成主要由MSC自身的状态和其所处微环境所决定［7］。多项研究结果表明，MSC在炎症刺激下可产生和分泌多种可溶性物质包括TNF-α刺激基因（TSG）、吲哚胺2，3-双加氧酶（IDO）、前列腺素E2（PGE2）和TGF-β1。TSG在正常环境下不表达，当受到TNF-α、脂多糖（LPS）等炎症因子刺激时可大量产生，进而抑制炎症因子的释放和中性粒细胞的浸润［8］。IDO是MSC发挥免疫调控功能的主要活性物质，其可通过调控色氨酸耗竭和积累代谢产物来抑制免疫细胞增殖［9］。PGE2在促进IL-10和IL-4抑炎因子分泌的同时，还可以抑制T细胞增殖和促进CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞（Treg）分化［10］。TGF-β1参与Treg的生成，抑制自然杀伤细胞增殖［11］。因此，MSC在炎性环境中可分泌更多有效的抑制AS的物质来延缓AS的进展［12］。除了分泌许多可溶性小分子物质，MSC还分泌大量的囊泡结构物质，包括外泌体、多囊泡小体和凋亡小体。研究证明，细胞外囊泡中含有多种遗传物质，如mRNA、微小RNA（miRNA，miR）和长链非编码RNA，以及蛋白质和线粒体等细胞器［13］。MSC分泌的细胞外囊泡与受体细胞融合，调控受体细胞内的转录和转录后水平，从而改善细胞的功能［14］。研究发现，MSC通过与受体细胞间进行遗传物质的传递，发挥调控细胞的增殖与凋亡、分化与迁移及改变斑块内免疫细胞组分、炎症和脂质水平的作用，进而影响AS的进展［15］。缺氧、炎症刺激等环境下可诱导MSC分泌更多的外泌体来影响斑块的进展，而正常环境下培养的MSC上清或其分泌的外泌体对斑块的作用明显降低，这提示我们MSC在炎症刺激等病理环境下能分泌比正常生理环境更多的有效的物质来调控炎症-免疫反应［16］。并且，MSC可通过传递正常的线粒体细胞器或线粒体DNA改善受体细胞的氧化应激状态和能量代谢［17］。二、MSC对AS的作用（一）MSC与血管内皮细胞（endothelialcell，EC）EC功能障碍是引起AS的始发因素。在脂质代谢紊乱和血流不稳定等AS高危因素的作用下，血管内膜受损，持续的炎症刺激和不断的脂质沉积导致EC发生功能障碍。EC功能障碍主要表现为内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和一氧化氮（NO）失衡，导致细胞内氧化应激水平增高，EC发生一系列的表型转换，包括炎症表型、泡沫细胞样表型等。研究指出，位于血管外膜和骨髓的巢蛋白（Nestin+）间质干细胞在慢性炎症的刺激下不仅可以向血管内膜迁移并分化为血管平滑肌细胞和EC，还可以分泌单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）促进骨髓腔内的单核细胞募集到循环中和斑块处，共同参与AS的发生发展。而当特异性敲除MCP-1基因，斑块中由单核细胞分化而来的巨噬细胞和自然杀伤细胞明显减少，减轻了血管壁炎症，抑制斑块进展［18］。然而，更多的研究发现急性短暂的炎症刺激可增强MSC对EC功能的改善作用，进而抑制AS的发展。NO主要由eNOS系统产生，发挥着维持血管舒张功能和保护EC功能的作用。而在AS的进展中，丝氨酸-苏氨酸激酶（Akt）/eNOS通路失活，导致eNOS降解，NO产生减少，EC产生活性氧增多，造成EC氧化应激水平升高，促进AS的发生。通过MSC与EC共培养发现，给予氧化型低密度脂蛋白刺激后MSC可通过上调IL-8和巨噬细胞炎性蛋白2的表达激活eNOS系统，促进NO的产生，改善EC的功能［19］。同时，MSC可通过分泌Wnt蛋白、活化β-连环链蛋白（β-catenin）介导的Wnt信号通路，减少因氧化应激导致的EC凋亡和改善EC功能［20］。经TNF-α刺激的EC表达细胞黏附分子增多，促进单核/巨噬细胞黏附募集，启动AS的发生。而用MSC的条件上清或提纯后的外泌体与骨髓来源的巨噬细胞共培养后发现，MSC可通过分泌肝细胞生长因子和抑制EC内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核转录因子-κB（NF-κB）通路来下调细胞黏附分子的表达，从而减少巨噬细胞的募集［21］。（二）MSC与血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）VSMC表型转换在AS的发生发展中发挥着重要的作用。在病理环境下，VSMC发生一系列的基因和信号改变，导致其表型由收缩型（分化型）向分泌型（去分化型）转换，表现为VSMC增殖、迁移、吞噬脂质、分泌炎性物质和胶原纤维等，影响斑块的形成和进展。近年来，研究发现斑块内的VSMC来源具有异质性且很少表达Scar-，它们可能来源于血管外祖细胞或肌成纤维细胞，有可能来源于骨髓干细胞，还有一部分常驻于血管中膜。然而，在AS的进展过程中，表达Scar-的VSMC增多，伴随着收缩型VSMC的标志蛋白包括肌球蛋白重链蛋白（Myh11）、肌动蛋白（Acta2）和胶转蛋白（Tagln）表达下调，分泌型VSMC的标志蛋白包括分泌型焦磷酸蛋白1（Spp1）和磷酸二酯酶1C（Pde1c）表达上调，并且VSMC的迁移和增殖能力增加，这提示了这部分VSMC发生了表型转换［22］。然而，VSMC对AS的调控具有两面性，即VSMC在初期斑块中分泌炎性物质、形成泡沫样细胞，而在晚期斑块中其分泌细胞外基质和胶原纤维、促进稳定性斑块的形成。因此，MSC除了可定向分化为VSMC样细胞、参与血管结构重建外，还可以调控VSMC的功能，且该调控机制在AS进程中也具有两面性。在AS早期阶段，MSC通过分泌包含let-7a的外泌体进入VSMC内，活化信号转导子与转录激活子（STAT）3-骨形态发生蛋白受体Ⅱ（BMPR2）信号通路来抑制VSMC的增殖［23］。而在晚期斑块中，MSC的条件上清可抑制骨形态发生蛋白2（BMP2）、Runt相关转录因子2（Runx2）和肌节同源框基因2（Msx2）的表达，并且通过活化B细胞淋巴瘤/白血病（Bcl）2/Bcl-2相关X蛋白（Bax）信号通路减少VSMC凋亡，这些机制都可能促进斑块向不稳定斑块方向发展［24］。然而，MSC通过调控VSMC表型转换来影响AS进程的机制研究仍未明朗，亟待进一步的研究。（三）MSC与巨噬细胞巨噬细胞是AS发生发展中调控固有免疫反应的关键细胞。循环中的单核细胞在炎症刺激下活化为巨噬细胞并募集到受损内膜下，参与抗原提呈、脂质吞噬、分泌炎症因子、形成泡沫样细胞、凋亡坏死等一系列过程来影响AS的发展进程。MSC可以调控巨噬细胞由促炎表型（M1型）向抑炎表型（M2）转换。不同的巨噬细胞表型表现出不同的功能，包括吞噬能力、分泌谱、抗原提呈能力、增殖与迁移能力和脂质代谢能力等，在AS的过程中发挥着不同的作用。目前认为，提高斑块中巨噬细胞M2与M1的比例可明显抑制斑块进展。相较于未进行MSC移植的AS小鼠模型组，经MSC治疗后的小鼠的动脉粥样斑块面积和脂质沉积明显减少，同时血管斑块内活化的炎性表型巨噬细胞数量下降伴泡沫细胞形成减少［25］。单核细胞与MSC共培养后，巨噬细胞表面蛋白重组人精氨酸酶1（Arg1）表达上调，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达下调；细胞上清中TNF-α等炎性因子分泌量减少，而IL-10等抑炎因子分泌增多；用氧化型低密度脂蛋白刺激巨噬细胞后细胞泡沫化明显减少；同时脂质吞噬受体CD36和类固醇受体RNA激活物（Sra1）表达下调，而脂质运输受体ATP结合盒转运体A1（ABCA1）和ATP结合盒转运体G1（ABCG1）表达上调［26］。进一步研究发现，MSC可传递多种miRNA于巨噬细胞，进而调控巨噬细胞内炎症和吞噬相关通路的转录水平和转录后水平，从而造成巨噬细胞发生表型转换和功能改变。目前已经发现的可调控巨噬细胞功能的MSC来源的miRNA包括miR-21-5p［27］、miR-a［28］、miR-30a［29］和let-7［30］等。另外，MSC同时分泌TSG、PGE2、TGF-β、IL-6等小分子可溶性物质，调控巨噬细胞的功能［31］。（四）MSC与T细胞1.MSC调控Treg的分化：T细胞是AS斑块中主要的适应性免疫反应调节细胞。研究认为，小鼠动脉粥样斑块内主要以CD4+T细胞为主，而人动脉粥样斑块中存在CD4+和CD8+T细胞。根据对AS的影响可将T细胞分为效应T细胞（Teff）和Treg。在AS的发展过程中，Treg的数量逐渐减少而Teff数量增多，因此我们认为Treg与Teff的比例下调可加速斑块进展［32］。Treg可直接发挥免疫抑制的作用，减轻斑块内的免疫反应，也可间接影响巨噬细胞的表型分化，共同调控抗动脉粥样斑块形成。目前研究发现，MSC不仅可分泌IL-10、TGF-β和PGE2来促进Treg的分化、改变斑块的免疫组分，还通过上调T细胞表面的Foxp3+来增强Treg的免疫抑制功能，进而达到抗AS的作用。2.MSC通过调控树突状细胞（dendriticcell，DC）影响T细胞分化：在AS的进展中，单核细胞活化后向动脉粥样斑块内募集并分化为巨噬细胞和DC，参与斑块的形成。近年来，研究发现Toll样受体（TLR）活化的CD11c+CD+DC也可调控Treg分化［33］。在载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠体内注射MSC不仅可以减少斑块内单核细胞来源的DC浸润，还能调控斑块内活化的DC的成熟［34］。3.MSC调控T细胞和巨噬细胞间的相互作用：此外，MSC来源的外泌体含有多种非编码RNA（如miR-33），可调控巨噬细胞泡沫化的过程。已有研究证实，miR-33可通过特异性地沉默肝脏细胞内的ABCA1受体表达来中断胆固醇运输，促进胆固醇在溶酶体上的积累［35］。此外，这些变化还伴随着斑块内Treg数量的减少，这表明在AS病理过程中巨噬细胞的免疫代谢和Treg的分化可能存在联系。此外，高胆固醇血症也可影响T细胞的分化。敲除CD4+T细胞的ABCA1受体后发现，T细胞向Treg分化增多，同时通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）介导的STAT5信号通路，可明显增加T细胞溶酶体上积累的胆固醇数量［36］。而T细胞发挥免疫调节功能依赖于细胞内胆固醇脂滴的激活，这一作用与前面所提到的MSC分泌miRNA下调脂质受体来增加内细胞内脂滴沉积的作用正好相反［37］。然而，MSC介导的巨噬细胞代谢与Treg分化之间的确切因果关系仍有待确定。MSC治疗AS过程中Treg和巨噬细胞发挥着重要作用。三、干细胞治疗AS的困难及解决方法以干细胞为基础的治疗方法在心血管疾病领域一直都是研究的热点，尤其是AS。然而，在研究的过程中仍然存在困难，导致干细胞治疗AS一直未见明显进展。（1）干细胞的异质性：干细胞治疗的效果很大程度上依赖于干细胞供者、组织来源和体外增殖纯化技术。如干细胞来源于有糖尿病、外周血管疾病等伴随疾病的患者，其治疗效果明显不如来源于健康志愿者的干细胞［38］。（2）不可避免地复制性衰老：衰老状态的细胞处于一种慢性氧化应激状态，伴有细胞内各种细胞器功能障碍。当在体外大量扩增提取MSC时，不断地传代不可避免干细胞衰老的发生，导致干细胞的功能受到影响，从而影响其治疗效果［15］。（3）预处理修饰后的干细胞具有更强大的调控功能：在MSC治疗AS的研究中发现，经过急性炎症刺激的MSC表现出比正常培养环境下更强大的分泌功能和更有益的治疗效果，主要体现在MSC的分泌谱发生了改变。但值得引起我们注意的是，在不同的预处理条件和时间影响下，MSC的分泌谱存在差异，也会导致MSC的疗效不稳定。基于目前干细胞治疗遇到的困难，研究者们已经在积极地寻找科学方法来提高干细胞的治疗效果。目前认为，为了确保MSC的治疗效果，首先要保证MSC的供者无严重基础疾病，且采用科学的、标准的方法来提取、分离、扩增MSC。其次，为了减少MSC衰老的可能性，要求体外扩增代数不得超过3代，并且及时进行衰老相关检测予以排除［35］。最后，当需要运用MSC的条件上清或细胞外囊泡进行治疗时，应尽可能地进行MSC培养条件的优化，包括短暂的炎症或氧化型低密度脂蛋白刺激、基因修饰和运用3D培养等方法来提高MSC的旁分泌功能［1］。MSC，特别是健康供者来源的MSC，在治疗动脉粥样硬化疾病方面具有很大潜力。然而，也存在许多可能影响MSC旁分泌功能的因素，这些问题需要进一步阐明，以促进其未来的临床应用。首先，由于MSC来源丰富，不同组织来源和分离环境都会影响MSC的免疫和炎症调节能力。因此，当移植这些不同来源的MSC治疗AS患者时，应该综合分析上述提到的影响MSC治疗疗效的因素，增强治疗效果。其次，对于稳定和不稳定的AS患者，考虑到不同的病理过程，在进行骨髓间充质干细胞（BMSC）治疗时需要慎重考虑不同的策略。未来我们需要进行更多精心设计的研究，以更好地了解在不同的炎症阶段如何进行MSC移植和治疗。再次，尽管旁分泌效应被认为是MSC调控炎症和免疫反应的主要机制，但其特异性分子，如多肽、小的非编码RNA或其他生物活性产物尚未完全明确。积极探索所有潜在的治疗分子，这将为MSC的治疗提供一个清晰的方向。最后，目前仍缺乏关于移植的MSC是否以及如何靶向AS斑块的可靠数据，我们也需进一步阐明BMSC归巢的具体机制，有助于提高MSC的治疗效果。另外，移植受体体内的内源性MSC也可能被来自健康供体的新鲜MSC重新激活，这可能MSC治疗的机制之一。所有研究问题的解答，必将阐明这一重要研究领域的一些基本科学问题，并为MSC治疗AS的临床应用铺平道路。所有作者均声明不存在利益冲突参考文献（略）
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