摘要：猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV），也是俗称的“猪蓝耳病”病毒，是世界上最重要的猪疾病之一。由于母猪繁殖障碍和各年龄段猪呼吸综合征，造成巨大的经济负担，在高致病毒株感染情况下，死亡率在2%至%不等。PRRSV与免疫系统相互作用复杂，突变率高，控制策略的制定和实施面临重大挑战。本文就病毒的生物学特性作一综述，重点介绍新发现的非结构蛋白功能和新的传播机制。其次，将回顾不同细胞类型和病毒蛋白在自然免疫和疫苗诱导免疫反应中的作用，以及不同的免疫逃避机制的作用，重点是那些知识的空白，这些知识的差距是产生更有效疫苗的关键。最后，将讨论抗原发现和疫苗开发的新策略，特别是胞外囊泡（内吞起源的外泌体）的使用。外泌体作为脂质、蛋白质和核酸的纳米载体，在细胞活化、免疫应答调节和抗原呈递等方面具有潜在的作用。因此，这代表了一种新的预防这种烈性传染病的疫苗接种方法。关键词：猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒，PRRSV，病毒生物学，免疫学，疫苗学，胞外囊泡1.经济影响PRRSV是导致断奶仔猪和育肥猪呼吸道疾病，以及母猪繁殖障碍的原因。它被认为是世界上最重要的猪病之一，估计每年给美国生产者造成6.64亿美元的损失，在过去8年里增长了18.5%。在欧洲，情况相似，并且在经济条件最坏的情况下，已经采用经济疾病模型确定了经济损失，其中包括生殖力衰竭和呼吸系统疾病，如果农场很小，则估计每年的中位数损失为75,欧元。如果在所有生产阶段都严重影响了1,头母猪的农场，则在护理和育肥过程中受到的影响最高可达,欧元。然而，由于多种因素（疫苗接种、治疗、呼吸症状、生殖衰竭和其他与PRRSV有关的疾病）使得在田间条件下准确量化这一参数的工作很难，因此，缺乏关于该疾病经济影响的信息。因此，PRRSV的确切经济影响仍然是该疾病知识的一个关键缺口。2.PRRSV的生物学特性猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRSV）于20世纪90年代初在欧洲和北美首次分离。根据国际病毒分类学委员会，它是一种包膜的单链正链RNA病毒，属于动脉炎病毒科,Porarterivirus属。目前，该属有四种不同的病毒、PRRSV-1和PRRSV-2（核苷酸序列有30-45%的变异），以及其他两种不影响猪的病毒（乳酸盐脱氢酶提升病毒和大鼠动脉炎病毒1）。PRRSV的基因组大小约为15kb，有10个开放阅读框（ORF），复制酶基因位于5’端，结构蛋白基因位于3’端。大多数基因组（～60–70%）编码参与复制的非结构蛋白（ORF1a和ORF1ab），而ORF2–7编码结构蛋白（N、M、GP2-GP5、E）（图1A、B）。在分子流行病学研究中使用ORF5，已描述了巨大的遗传变异性。然而，关于全基因组测序的数据非常缺乏，这构成了对这种病毒及其进化知识的另一个重要缺口(方框1)。PRRSV复制酶基因由两个ORF（ORF1a和ORF1b）组成，它们占据基因组的5’近端四分之三（图1A）。两者都是从病毒基因组表达的，ORF1b的表达依赖于保守的核糖体移码机制。随后，对产生的pp1a和pp1ab多蛋白进行广泛的蛋白水解处理产生至少14种功能性非结构蛋白（nsps），特别是nsp1到nsp12，其中nsp1和nsp7部分都受到内部切割（分别起源于nsp1α和nsp1β，以及nsp7α和nsp7β），其中大多数组装在一起形成膜相关的复制和转录复合物。最近，在PRRSV和其他动脉炎病毒中发现了编码另一种ORF的程序化核糖体移码，该ORF产生两个额外的蛋白质，nsp2TF和nsp2N。这些针对PRRSV的nsps已被证明对于诱导类似于在感染细胞中发现的膜修饰是必要和充分的。最重要的是，所有正链RNA病毒似乎都可以诱导膜修饰的两种基本形态类型之一：内陷或双膜囊泡。PRRSV还具有一组8种结构蛋白，包括一个小的非糖基化蛋白和一组糖基化蛋白：GP2a-b、GP3、GP4、GP5和GP5a、M和N蛋白。然而，传统上被归类为非结构蛋白的nsp2被发现与病毒包膜内的多种异构体（卵巢肿瘤结构域蛋白酶区、高变区和C末端区）结合，从而对这种病毒的结构提供了新的见解（图1B）。首先，PRRSV的核衣壳蛋白(N)作为成熟病毒颗粒中最重要的部分之一，已被深入研究，发现了大多数非节段RNA病毒所共有的重要特征。基因2的N蛋白由个氨基酸组成，基因1的N蛋白由个氨基酸组成。病毒包膜糖蛋白（GP2到GP5）是第一个与宿主细胞受体相互作用的分子，当病毒颗粒进入血液和淋巴组织循环时，这些糖蛋白就开始感染并暴露于免疫系统中（图2）。还有另一种有助于病毒体结构的蛋白质M蛋白，在病毒进入过程中，需要与巨噬细胞上的硫酸乙酰肝素细胞受体相互作用。后来，GP5被认为与唾液酸粘附素结合，病毒内化和脱壳是由带有CD受体的病毒异源三聚体（GP2a、GP3和GP4）的形成而触发的（图2）。GP5是最丰富的糖蛋白。首先，它与两种细胞进入介质，硫酸乙酰肝素糖胺聚糖和唾液酸黏附素/CD相互作用以促进病毒进入，然后可能与N蛋白及其类似MHC的结构域一起携带N-病毒RNA复合物带到出芽位点（图2）。像大多数PRRSV膜蛋白一样，GP2、GP3和GP4受聚糖屏蔽保护，以避免抗体识别和中和。GP2具有两个糖基化位点，GP3具有七个糖基化位点，GP4具有四个糖基化位点，其中三个与病毒存活直接相关，当其中两个以上位点发生突变时，会在病毒生产中造成致命性损害（图2）。3.病毒在宿主细胞中的复制和侵入机制病毒复制开始于病毒糖蛋白与不同细胞受体的相互作用(图2)。CD和CD在病毒感染、病毒颗粒脱壳、网格蛋白介导的内吞和病毒基因组在细胞质中释放等过程中起主要作用。通过评价PRRSV对CD敲除猪的影响，CD被定义为病毒感染的主要受体，在那里有完全的抗感染能力。该受体中富含半胱氨酸的5区似乎是建立与PRRSV-1物种相互作用的必要条件，CRISPR/Cas9系统（编码该区域的基因第7外显子）敲除该区域可以为病毒提供保护，这一点在编辑的猪巨噬细胞和SRC5动物的体内实验中被证实。更重要的是，编辑后的猪在标准饲养条件下没有出现副作用，而CD似乎在缺乏富半胱氨酸5结构域的情况下仍能维持其生物学功能(血红蛋白-接触珠蛋白清除剂)，然而，其他未知的功能可能会因这种修饰而受损。综上所述，缺乏CDSRCR5区域的基因编辑猪可能是对抗PRRSV流行的重要资产，最终目标是根除PRRSV。CD似乎仅与病毒体表面中与唾液酸的相互作用有关，然而，CD外显子1、2或3的敲除猪不受感染，病毒载量和抗体反应与杂合子猪（CD+/-）或野生型猪（CD+/+）（25）相似。之前的实验表明，PRRSV感染可能涉及其他未知的机制，如其他受体、不同于巨噬细胞的新的未知易感细胞类型或敲除模型中CD遗漏表达。其他分子也参与病毒进入，如CD和波形蛋白；阻断这四种分子中的任何一种（CD、CD、CD和波形蛋白）对病毒感染有影响，无论是对病毒的内化还是对病毒复制的完全抑制。PRRSV进入细胞后，引起一系列的细胞内修饰以完成其复制周期，包括细胞膜细胞器的重排以产生复制复合物。这包括明显来源于内质网的核周双膜囊泡的形成、基因组RNA(gRNA)的合成、片段RNA(sgRNA)的转录和病毒蛋白的表达。在复制的后期，成熟的病毒粒子聚集在细胞内膜室中，然后通过胞吐作用释放到细胞外空间。在包括PRRSV在内的几种病毒中发现了一种非经典传播途径，病毒传播是通过细胞到细胞的纳米管介导的。据报道，几乎所有PRRSV蛋白都与肌球蛋白和肌动蛋白(特别是f-肌动蛋白和肌动蛋白IIA)相互作用，其中纳米管连接细胞，允许结构蛋白和RNA的移动，即使在细胞培养基中存在中和抗体，也以一种非经典的方式感染na?ve细胞。此外，这一非经典途径表明，PRRSV细胞进入受体不是建立感染的必要条件，因为当非受纳管细胞与被感染细胞接触时，就会被感染。已经提出这种传播策略是通过在相邻细胞膜之间传递病毒颗粒来促进感染的机制，或者是与受体无关的感染机制。重要的是，已经报道了其他病毒，例如HIV-1，其感染后巨噬细胞上的纳米管数量增加，疱疹病毒在牛成纤维细胞之间传播。有趣的是，尽管在纳米管中被检测到了几种病毒蛋白（nsp1β、nsp2、nsp2TF、nsp4、nsp7、nsp8、GP5和N），但GP4只在少数纳米管中被检测到。特别是，GP4在这一非经典扩散通路中的作用还没有被完全理解，进一步评估GP4与其他细胞成分的相互作用，以阐明GP4为什么没有被运输到新的受体na?ve细胞将是很有趣的。总之，这些数据表明，尽管PRRSV在体内表现出对单核细胞和巨噬细胞狭窄的细胞趋向性，但它已经进化出不同的传播途径（方框1）。4.PRRSV的免疫学及其免疫逃逸机制4.1先天性免疫反应先天性免疫应答是任何给定病原体遇到的第一个系统，特别是为了防止病毒复制和侵入粘膜组织（对于PRRSV而言是呼吸道），并且重要的是，启动强大的适应性免疫反应来对抗细胞内感染因子。Ⅰ型干扰素（IFNα/β）是在感染初期抵抗病毒入侵的最有效的机制之一，它触发了一系列IFN刺激基因（ISG）。一般来说，所有有核细胞都有能力产生IFNα/β，但浆细胞样DC(pDC)是这个家族细胞因子最强大的生产者。PRRSV在体内已进化出一套抑制IFNα/β的机制，在肺部短暂升高后不久，这种细胞因子在感染猪身上保持低表达水平。PRRSV体外感染MARC-和猪肺泡巨噬细胞对IFNα/β也有抑制作用。进一步的研究表明，抑制Ⅰ型IFN表达是PRRSV调节宿主抗病毒防御的主要策略。事实上，一些病毒蛋白已经被鉴定为IFN拮抗剂(nsp1α、nsp1β、nsp2、nsp4、nsp11和N)。以N蛋白为例，在dsRNA刺激下，IFN-β的产生随着N表达水平的增加而成比例地减少，此外还发现通过dsRNA干扰dsRNA诱导的IRF3的磷酸化和核易位来下调IFN依赖性基因的产生。在具有I型IFN调节能力的PRRSV非结构蛋白中，nsp1通过作用于干扰素调节因子3（IRF3）磷酸化和核转运被认为是IFNβ产生的最强拮抗剂。除了nsp1外，几乎所有非结构蛋白都与胞内膜相关的核周区有关，推测是来源于内质网（ER），其被修饰成囊泡双膜结构，病毒复制和转录复合体（RTC）被认为与之相关。Nsp1在感染的最初几个小时内转移到细胞核，在其中它能够抑制IRF3与CREB结合蛋白（CBP）的结合，通过蛋白酶体依赖性机制促进CBP降解，否则，转录增强体可能无法组装转录机制用于干扰素表达。最近，研究表明PRRSV通过上调猪肺泡巨噬细胞细胞miRNA来调控IFNβ转录后的蛋白表达。Nsp2是最大的（成熟）PRRSV蛋白，至少包含四个不同的结构域：N端CP/OTU结构域、一个中心高变区、一个假定的跨膜结构域和一个功能未知的C端区域，其中富含保守的半胱氨酸残基。这种蛋白在PRRSV中是独特的，因为它的遗传异质性，它参与支持病毒复制周期的不同角色，以及它在PRRSV病毒粒子中的包装。先前的研究表明，nsp2具有与免疫逃逸机制相关的不同作用。已经确定nsp2OTU结构域通过干扰IkBα的多泛素化过程来抑制活化B细胞的核因子κ轻链增强子（NF-kB），并且随后，抑制IkBα蛋白的降解。此外，与亲本病毒相比，nsp2中的存活缺失突变体在感染细胞时会导致细胞因子（IL-1β和TNF-α）mRNA表达下调，这表明nsp2的某些区域可能导致病毒特异性宿主免疫反应的诱导,删除这样的一个区域可能产生毒性更强的病毒。nsp2有几种亚型，在毒株之间具有一致的核心集，在复制的最后阶段被整合到成熟的病毒粒子中(图1B)，尽管其中一些可能具有毒株特异性。PRRSV病毒粒子中包含nsp2表明，它可能以与细胞外功能，侵入或病毒早期快速复制相关的以前未知的角色起作用。还发现了nsp2的截短形式，命名为nsp2TF和nsp2N，在免疫逃逸的调节中具有明显的作用。当使用这些形式的缺失突变体感染细胞时，基因表达发生了显著变化，参与细胞因子-细胞因子受体相互作用、TNF信号转导、toll样受体信号转导、NOD样受体信号转导、NF-κB信号、RIG-1样受体信号、趋化因子信号、JAK-STAT信号、胞质DNA信号和NK细胞介导的细胞毒性，表明这些截断形式在调节宿主细胞先天免疫应答中发挥了积极的作用(直接或间接)，使PRRSV感染周期比最初认为的更加复杂。Nsp11是一种Nidovirus保守性内核糖核酸酶，具有尿苷酸特异性核酸内切酶（NendoU）。体外实验证明，nsp11的过表达提高了病毒的滴度。此外，nsp11拮抗I型IFN，特别是由维甲酸诱导基因1样受体激活的IFNβ产生，显示对线粒体抗病毒信号蛋白（MAV）和RIG-I（转录物和蛋白质）的底物特异性，并证明该活性与该蛋白的内啡肽酶活性有关，在该蛋白中，转染突变病毒不能降解MAVSmRNA并损害IFNβ的产生。这种蛋白限制抗病毒反应的另一种机制与炎症小体和IL-1β的合成有关，因为它在先天性和适应性免疫反应以及病理机制中都起着重要作用。通过检测猪肺泡巨噬细胞(PAM)中IL-1β和IL-1β的mRNA和IL-1β成熟蛋白的水平，表明PRRSV可在感染早期激活NLRP3炎症小体，但在感染后期诱导宿主的免疫抑制。毫不奇怪，nsp11也与RNA沉默复合物（RISC）相互作用，因为在MARC-细胞系中已在体外证明该蛋白和nsp1α负责抑制RISC和下调argonaute-2蛋白表达的增加。病毒滴度显著提高，这表明这种沉默复合物与病毒复制至少在体外具有直接关系。其他非结构蛋白已经被研究过了，但在体内和体外功能以及信号通路的相互作用方面还存在着重要的知识空白。此外，毒株之间的巨大差异使得很难描述所有的蛋白质变体以及与细胞系(巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞等)的相互作用（方框1）。最近，有大量证据表明，在呼吸道和生殖系统感染PRRSV后，宿主基因的变化与疾病的不同发展有关。虽然特异性抗病特性的途径和机制尚未完全确定，但很明显，疾病恢复力的遗传变异是多基因的，可调节先天抗性和获得性免疫方面。与先天性免疫反应有关，PRRSV感染后的平均日增重（ADG）与4号染色体（SSC4）中的单个基因组区域相关，该区域最好由SNP标签标记WUR代表，该区域位于CRS的3’非编码区域干扰素诱导鸟苷酸结合蛋白1（GBP1）基因。PRRSV研究历来忽略了猪对PRRSV感染的遗传抗性，这可能在免疫反应研究中产生混杂因素。PRRSV的一个主要知识缺口是，在PRRSV感染后，猪的遗传变异性与病毒本身的巨大变异性相关（方框1）。在猪体内，PRRSV在属于先天免疫系统的细胞中复制。PAMs是肺部和单核/巨噬细胞系其他细胞中的主要细胞，后者随后可将病毒传播到其他组织或支持复制，以将病毒颗粒释放到血液中（图2）。此外，PRRSV还被认为能够通过诱导凋亡、下调IFN-α、MHCⅠ、MHCII、CD11b/c和CD14的表达，感染专业抗原提呈细胞，如DC和单核细胞衍生树突状细胞，（MoDC）会损害其正常抗原表达能力，上调IL-10表达，诱导Th1细胞因子分泌。然而，通过体内和体外实验的新证据表明，特别是肺cDC1，cDC2和MoDC并未被亚型1和亚型3的PRRSV-1病毒感染，一种可能的解释是在这3种DC亚型中CD和CD的表达较低，将先前在DC中感染的结果与体外单核细胞的培养条件相关联，这可能提高某些毒株（如Lena）对感染的敏感性。此外，这些发现也在扁桃体cDC和气管cDC1和cDC2中进行了检测，观察这些细胞群没有被PRRSV病毒感染。此外，一种新型的PAM被命名为猪血管内巨噬细胞（PIM），因为它与肺毛细血管内皮细胞有关，而不是肺泡，具有很强的吞噬血液相关颗粒的能力。重要的是，与正常肺泡巨噬细胞相比，当感染的PIM细胞产生的病毒负荷结果与感染的PAM细胞相似，但感染后TNFα显著上调，IL-6和IL-8表达无显著上调，表明这些细胞在肺部PRRSV感染过程中起重要的促炎作用。细胞和病毒之间新的相互作用需要进一步探索，以阐明可能导致相关保护的免疫特征。最近，已经显示出Nsp1α内的结构域能够刺激CD83的分泌，这又在体外抑制了MoDC的功能，损害了MoDC刺激T细胞增殖的能力。在PRRSV感染过程中，IFNα/β的产生和pDC激活细胞的机制被严重抑制，尽管这些细胞不允许PRRSV感染。但是，这种现象与毒株有关，因为其他PRRSV毒株能够刺激pDC大量产生IFNα/β。同样，PRRSV毒株与它们对抗原提呈细胞的影响有很大的差异，这阻碍了科学家们找到其共同的机制。将PRRSV的这一关键知识缺口与宿主遗传学联系起来可能是有兴趣的（方框1）。此外，在PRRSV感染细胞中，N的大量表达得益于不连续的转录机制。该蛋白也分布在细胞核中，由两种核定位信号诱导产生，分别是crypticNLS或NLS-1和functionalNLS或NLS-2(位置分别是10-13和41-47)。通过转染PAMs和MoDCs检测了N蛋白的作用，发现IL-10基因表达显著上调。自然杀伤（NK）细胞构成了先天免疫系统对抗PRRSV的另一个强大的武器，特别是考虑到猪体内循环NK细胞的高百分比。PRRSV感染后第2天至3-4周，NK细胞的细胞毒性功能降低。利用体外系统进行的初步研究表明，用促炎细胞因子（IL-2和IL-15）刺激猪NK细胞能够激活NK细胞，并诱导它们表达高水平的IFN-γ和穿孔素，从而导致感染细胞溶解，但如果在感染后对细胞进行评估，则会出现不同的情况，表明一种病毒如PRRSV能够损害NK细胞的细胞毒性。在体外，抗PRRSV感染PAMs的NK细胞毒性降低，NK细胞脱颗粒受到抑制。在体内，免疫反应与在体外观察到的相同，一些研究报告，大约一半的病毒血症猪NK细胞介导的细胞毒性降低50%，IL-4、IL-12的分泌增强，细胞毒性T细胞（CD4?CD8+T）和双阳性T细胞（CD4+CD8+T）频率降低，调节性T细胞（Tregs）频率上调。4.2获得性免疫反应针对PRRSV的先天免疫反应和适应性反应受到不同机制的阻碍。适度和延迟的B细胞介导的中和性抗体反应是PRRSV获得性免疫反应的主要特征之一。尽管PRRSV特异性抗体在感染后7-9天早期出现，但这些抗体的效果尚不清楚。中和抗体需要更长的时间，在感染后近1个月出现。然而，在PRRSV繁殖模型中，这些中和抗体的被动转移几乎能提供完全的保护（95％的后代在以高中和抗体滴度攻击怀孕母猪后仍存活）。然而，在另一个使用繁殖模型的实验中，当中和抗体转移后检测PRRSV的存在时，肺、扁桃体、血沉棕黄层细胞和外周淋巴结都含有复制的PRRSV，与感染对照相似，尽管猪明显受到保护而不受感染。总之，高中和抗体滴度的被动转移可为后备母猪和后代提供保护（检测不到病毒血症），但不能消除周围组织中病毒颗粒的存在，也不能消除其与之接触动物之间的传播。奇怪的是，中和抗体在预防呼吸道疾病方面的作用是PRRSV的关键知识缺口。这一点对这种病毒的体液免疫反应准确地确定改良疫苗的靶标至关重要（方框1）。N蛋白参与多种免疫逃逸机制，并且也是最具免疫原性的结构蛋白之一。抗N的抗体与抗M和GP5蛋白的抗体一起在急性感染早期出现，但没有中和作用，可能与抗体依赖性增强有关。还有其他“抗体相关机制”不一定涉及中和活性。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖性补体介导的细胞毒性（CDC）和抗体依赖性补体介导的病毒溶解（ADCV）已在PRRSV的背景下进行了研究，尽管这些机制在感染过程中都不明显，也没有在这种病毒的体外和体内模型上被深入研究。值得注意的是，中和抗体在PRRSV感染后期出现，其他免疫机制（细胞或抗体介导的免疫反应）可能起到抑制血液中病毒复制的作用，导致病毒在淋巴组织中分离，并维持次优复制，最终以病毒清除结束。对于PRRSV-2型病毒，已经证明用GP5/M复合物的胞外域肽免疫猪不会产生中和抗体，尽管产生的胞外域特异性抗体能够与病毒结合。难以验证中和表位的一个重要特征是其内或周围的糖基化数目。对于PRRSV-1株，在GP5中和表位(位于37-45氨基酸之间)中或其两侧可能发现多达3个糖基化位点，而对于PRRSV-2株，则有四个潜在的糖基化位点。经测试，PRRSV在GP5糖基化位点（在N44或高变区、中和性表位的上游）具有突变，从而增强了免疫原性，针对该表位的抗体浓度比野生型毒株诱导的抗体高5-10倍。另一个去糖基化突变体（GP5上假定的糖基化部分有两次去糖基化）获得了相同的结果，从而赋予了更好的针对同源攻击的保护。此外，当这种蛋白在感染过程中早期表达时，它会刺激早期中和抗体和IFN-β的产生，这是两种主要的抗病毒机制，证明了其在诱导宿主自我保护机制中的作用。关于由该蛋白诱导的中和抗体的可用数据存在争议，这可能是由于PRRSV株之间的高度变异以及如前所述的宿主遗传学所致。ORF5还辅之以称为ORF5a的亚基因组mRNA的一个小的移码，编码一种I型膜蛋白，主要由α螺旋和跨膜结构域（称为GP5a）组成，该结构域作为一个很小的组成部分并入病毒粒子，在病毒复制中发挥作用，如起始密码子突变或早熟与该蛋白表达相关的终止导致非有效的病毒复制和较低的滴度。这种蛋白能够在自然感染和免疫接种后引发特异性抗体免疫应答，尽管在攻毒试验中这些蛋白既不能中和也不能保护，这使得很难确定这种特殊的小蛋白在PRRSV感染的整个免疫应答和病毒清除中的作用。总之，体液免疫在PRRSV感染（中和和非中和抗体）中的作用仍不明确，需要更好的特性描述来弥补这一相关的知识空白（方框1）。Treg通常在慢性病毒性疾病中增加，以防止持续的炎症反应和与病毒感染相关的病理损害。相反，Tregs被描述为调节宿主对病毒感染的免疫反应的关键因素。该细胞群是调节针对感染（在诸如HIV和HCV等病毒中）的免疫反应强度的重要组成部分，从而防止过度的炎症和组织损伤。但是，它们也可能会被病毒不适当地诱导，改变免疫反应的平衡，有利于维持病毒复制。在PRRSV中，Tregs的作用尚不清楚，似乎是一些毒株在感染后2天内诱导IL-10的结果。在一些实验中，体外感染PRRSV-1的树突状细胞表现出不平衡的能力，以毒株依赖的方式刺激T细胞免疫反应，但至少在体外，通过CD25和FoxP3标记物的表达测定，没有检测到Treg。当使用PRRSV-2菌株时，情况似乎有所不同，因为该病毒能够刺激IL-10的产生，同时产生与体外系统中核衣壳蛋白表达相关的Tregs。这组研究还表明，IL-10和Treg的产生可能与γ-干扰素（IFN-γ）的产生受损以及通过抑制T细胞增殖而改变保护性T细胞反应的变化有关，这在感染病毒(如HCV)的早期阶段可见。美国目前使用的疫苗株不能提供足够的异源保护，一种可能的解释可能是由于它们至少在体外具有刺激Treg的能力而无法诱导足够的IFN-γ反应。表达的N蛋白的结构构象，而不是核定位，被认为是诱导IL-10能力的必要条件，因此，通过CD4+CD25+Foxp3+标记物检测，IL-10诱导treg。值得注意的是，当使用缺失突变体评估核定位信号的作用时，结果表明NLS-2对病毒存活不是必需的，尽管猪产生病毒血症的持续时间显著短于野生型PRRSV感染的猪，并且产生了更高的中和抗体。Tregs细胞在抗PRRSV免疫应答中的作用是开发更有效的PRRSV疫苗的关键知识缺口（方框1）。此外，报道强调了PRRSV感染对胸腺细胞数量的影响，主要表现为PRRSV感染猪胸腺中CD4+/CD8+细胞的减少。急性淋巴细胞减少，胸腺萎缩和淋巴结病与胸腺中PRRSV抗原的存在有关，是PRRSV抑制免疫应答的一些机制。此外，胸腺中PRRSV抗原的存在也可以诱导耐受，并提出了一种机制来解释PRRSV感染期间Tregs的存在。目前的研究还在继续，了解PRRSV对胸腺细胞发育影响的基础知识将对理解这种病毒在宿主中的作用产生极大的兴趣。由于不同病毒毒株与宿主之间的复杂相互作用，PRRSV免疫学仍然是一个尚未解决的难题。类似的免疫反应可能是该病毒的主要特征，如持续性病毒血症、对固有细胞因子（IFN-α/β、TNF-α、IL-1β、IFN-γ）的强烈抑制、NK细胞功能的失调（细胞毒性和脱颗粒）、非中和抗体的快速诱导、中和抗体的延迟出现、晚期和低CD8+T细胞反应和调节性T细胞（Tregs）的诱导。总的来说，中和抗体和PRRSV特异性IFN-γ分泌细胞不能完全描述与保护性免疫相关的免疫效应功能，因为与它们相关的病毒靶点尚不清楚。因此，由于在体外和体内试验的艰苦工作以及巨大的遗传多样性，这种感染的保护相关性仍然难以捉摸，这种多样性造成了混淆，使得在交叉保护性免疫预测模型中很难预测针对一个分离物或毒株的免疫应答如何应用于另一个分离物或毒株上。毫无疑问，PRRSV最重要的知识缺口是缺乏对不同毒株之间免疫保护的了解，这使得很难建立强有力的模型来评估疫苗对该疾病的疗效（方框1）。5.蓝耳病的疫苗免疫策略5.1经典毒株与变异毒株疫苗自从PRRSV在欧洲和美国爆发以来，开发有效的PRRSV疫苗一直是一项挑战。经典毒株疫苗效果一般，原因有几个：病毒突变可导致更多的病原毒株，缺乏关于猪免疫系统如何与所有PRRSV蛋白相互作用的知识，最重要的是，没有可靠的参数（替代标记）可以明确地将其与病毒清除率联系起来。因此，完全同源或异源保护与经典的免疫学参数（如特定细胞群的增加/减少、IFN-γ产生、中和抗体、非中和抗体和临床结果）之间没有关系。此外，高度变异的病毒毒株使得开发一种通用型的疫苗更加困难。几种不同的抗PRRSV疫苗已经上市，并在最近进行了综述。这些疫苗大多数为针对PRRSV-1的修饰活病毒(默克公司的PorcilisPRRS、勃林格公司的IngelvacPRRSFLEXEU、海博莱公司的amervacPRRS、Syva公司的Pyrsvac-)，以及一些控制PRRSV-2的病毒(硕腾公司的FosteraPRRS、勃林格公司的IngelvacPRRSMLV/IngelvacPRRSATP)。也有证据表明，PRRSV-1和PRRSV-2两种MLV疫苗都能引起特异性的体液和细胞介导免疫(CMI)反应，因为它们能保护同源亲本毒株，部分保护异种毒株。虽然合理地使用MLV可以控制一些PRRSV的暴发，但仍存在重大的安全问题，如高突变率导致毒力逆转以及疫苗和野生型毒株之间的重组。据报道，由于MLV疫苗而引入新病毒的病例。例如，非典型丹麦分离株与疫苗病毒resprrs的核苷酸序列同源性在99.2%到99.5%之间，与疫苗病毒的亲本VR的核苷酸序列同源性在99.0%到99.3%之间，这支持了在丹麦引入PRRSV-2是由于疫苗病毒传播的结论。在中国报道了一个病毒重组事件，在非结构蛋白2（nsp2）基因中有核苷酸缺失和插入的PRRSV变异体体现了MLV株和中国本地分离毒株之间可能发生了基因重组。目前的灭活疫苗方法不是非常有效，因为引发的免疫反应不足以控制病毒的传播。但是，这种疫苗可以在野生型病毒感染或PRRSV-MLV疫苗接种后增强记忆蛋白中和抗体和病毒特异性IFN-γ应答，从而有助于病毒清除。因此，改良的活疫苗与灭活疫苗的组合可能是在田间条件下控制该病的合理方法，但不幸的是，目前尚无可靠的数据将该方法与市场上的其他方法进行比较。另一方面，大多数灭活疫苗未获准在美国使用，在攻毒试验中，通过生产PRRSV特异性中和和非中和抗体以及低细胞免疫反应来衡量，较差的疗效其退出了猪市场。据爱荷华州立大学食品安全与公共卫生中心称，只有“BIOSUISPRRSInactEU+Am”被批准在美国使用。然而，人们正在评估克服这些问题的新策略，包括纳米颗粒包被抗原、基于植物的方法或载体疫苗。人们曾多次尝试使用结构蛋白来开发PRRSV疫苗，因为它们是中和抗体的特定目标。因此，我们可以假设针对这些蛋白质的抗体可能是抑制病毒复制和传播的关键，因为这在许多病毒中都很常见。已经测试了诸如VLP结合不同结构蛋白的方法，发现在先前接种或感染的猪中，可能出现记忆反应（增强IgG和IFN-γ产生细胞）。这些结构蛋白能够激活免疫系统，但攻毒后未观察到病毒血症的减少。这些结果提示，其他病毒蛋白可能是诱导猪保护性反应的靶点。对这一发现的合理解释可能是由于它们的序列中存在少量中和性表位(大多数位于蛋白质的可变区域)，以及表位的糖基屏蔽现象和PRRSV病毒株之间观察到的高变异性。再次，PRRSV的一个关键知识缺口是精确地描述所有PRRSV菌株中存在的共同表位。负责产生引起交叉保护性免疫的有效免疫应答的表位，至今仍难以确定。综上所述，该证据表明需要符合无病原体策略的新疫苗接种方法，该方法能够引发有效的细胞和抗体反应，并具有对同源毒株的中长期保护，并且对异源毒株也能提供保护。5.2胞外囊泡作为一种新的疫苗接种方法胞外囊泡(EVs)作为一种新型的传染病疫苗，是具有兽医重要性的动物疾病疫苗，其自身抗原呈递能力、激活宿主细胞和抗体免疫反应，更重要的是，在致命攻毒试验中诱导保护作用，正受到越来越多的科学
